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2광자 현미경을 위한 레이저 변조 솔루션
개요<
1990년에 출판된 2광자 레이저 스캐닝 형광 현미경에 대한 획기적인 연구(Denk, et al., 1990) 이후, 이 기술은 레이저 기술의 단계적 변화로부터 이익을 얻었습니다. 이러한 개선으로 인해 처음에는 물리학 실험실에서 세포 생물학, 질병 연구 및 고급 신경과학 이미징에 이르기까지 기술이 더욱 널리 보급되었습니다.
하나의 상자, 조정 가능한 Ti:Sapphire 레이저는 2001년경에 이러한 추세를 시작했습니다. 몇 년 후 자동 분산 제어 기능이 레이저에 추가되어 현미경의 샘플 평면에서 펄스 지속 시간을 최적화했습니다. 상한보다 긴 파장에서 여기 가능한 프로브로서Ti:사파이어 레이저2010년 레이저 회사가 증강된 색상 팔레트, 더 깊은 이미징 및 더 적은 광손상에 대한 요구를 해결하기 위해 광학 파라메트릭 발진기로 전환한 이후 더욱 성숙하고 효율적이 되었습니다.
이 문서에서 우리는 이 진화의 다음 단계에 대해 논의합니다. 레이저 시스템에 빠른 전력 변조를 통합하고 이를 통해 설정 시간을 단축하고 성능을 극대화하며 소유 비용을 낮추는 방법을 설명합니다.
"레이저 시스템에 빠른 전력 변조 기능이 통합되어 설정 시간이 빨라지고 성능이 향상되며 소유 비용이 낮아집니다."
2광자 현미경의 레이저 출력 제어 요구사항
가장 간단한 형태로 위상 지연 파장판과 편광 분석기를 추가하면 레이저 출력을 지속적으로 제어할 수 있습니다. 파장판을 회전시키면 분석기를 통한 레이저 전력의 투과율이 일반적으로 0.2% 투과율에서 ~99%로 변경될 수 있습니다. 예를 들어 파장판을 모터화하면 이 프로세스를 자동화하여 현미경의 이미징 평면에서 전력을 변경하여 다양한 깊이 프레임에서 집중된 플루언스를 균등화할 수 있습니다.
그러나 대부분의 최신 레이저 스캐닝 2광자 현미경은 더 빠른 변조 속도를 요구합니다. 예를 들어, 데이터 수집이 단일 방향으로만 이루어져야 하는 래스터 레이저 스캐닝 응용 분야의 경우 원치 않는 형광 여기 또는 광표백을 방지하기 위해 "플라이백 작업" 중에 레이저를 꺼야 합니다. 공진 검류계 스캐너의 경우 결과적인 상승/하강 시간은 몇 마이크로초만큼 작을 수 있습니다. 이 영역에서는 광 변조 방법을 고려해야 합니다.
전기광학 변조
EOM(전기 광학 변조기)은 포켈스 효과를 사용하여 빔에 위상 지연을 적용하여 레이저 출력을 변조합니다. 이는 전기장을 적용함으로써 중심대칭이 아닌 결정에서 복굴절이 유도되는 곳입니다. 이전과 마찬가지로 변조기 설정을 완료하기 위해 편광 분석기가 사용됩니다.
포켈스 셀은 상대적으로 짧은 결정을 가진 더 큰 빔을 수용하기 위해 종방향 여기 기하학으로 구성될 수 있습니다. 이 경우 일반적인 ½파 전압(즉, 편광의 90도 회전에 필요한 전압)은 대략 6kV이며, 이는 2P 현미경의 속도와 듀티 사이클에서 달성하기 어렵습니다. 따라서 대부분의 이미징 구성은 더 긴 결정을 사용하는 횡방향 전기장 기하학을 채택하여 반파장 전압을 크게 낮춥니다. 크리스털은 일반적으로 2개 이상의 직렬 구성으로 배치되고 서로에 대해 회전하여 필요한 스위칭 전압을 더욱 낮추고 열 부하 효과를 보상합니다.
최상의 이미지 대비를 위해 결정 정렬 및 오프셋(바이어스) 전압 조정을 통해 펄스 대비(최소 전송 전력 대 최대 전송 전력의 비율)를 최적화하는 데 주의를 기울여야 합니다.
그림 1:횡방향 포켈 셀 연산의 단순화된 표현입니다. 분석기를 통한 전송은 적용된 전기장의 조정에 의해 변조됩니다.
포켈 셀은 2광자 현미경에서 널리 채택되고 있으며, 특히 인기 있는 2광자 파장에서 보통의 출력만 필요한 사용자의 경우 상대적으로 간단하게 배포되므로 '주택 건축업자' 커뮤니티에서 널리 채택됩니다.
예를 들어, 인산이중수소칼륨(KD*P) 기반 셀은 최대 약 1100nm의 2P 응용 분야에 대한 뛰어난 투과율, 속도 및 대비 특성과 적당한 레이저 출력을 제공합니다. 또한 KD*P는 군속도 분산 특성이 낮아 군지연 분산(GDD)이 최소화됩니다. 이를 위해 KD*P Pockels 셀은 Ti:Sapphire 레이저와 같이 분산 사전 보상 및 제한된 조정 없이 초고속 레이저를 사용할 때 널리 사용되는 선택입니다.
그림 2:2광자 현미경에 일반적인 포켈스 셀 배치. EOM은 사용자의 오른손 바로 아래에 있습니다. 사진 사진 제공: 영국 옥스퍼드 대학교 Packer Lab.
음향-광학 변조
음향 광학 변조기(AOM)는 압전 변환기가 부착된 투명한 크리스탈 또는 유리로 구성됩니다. 변환기에 적용되는 무선 주파수(RF) 파는 굴절률 격자를 생성하는 결정에 변형을 주는 음파를 유도합니다. 세포를 통해 이동하는 빛은 브래그 회절을 겪습니다.
달성 가능한 상승/하강 시간은 음파가 레이저 빔을 통과하는 데 걸리는 시간에 비례하므로 결정의 빔 폭을 줄여 최적화됩니다.
식별 및 이에 따른 명암비는 분리 각도(θS) 0차와 1차 회절 차수와 관심 작업 평면까지의 거리 사이
"680-1300nm 정도이고 출력이 2W를 초과하는 단일 상자로 광범위하게 조정 가능한 레이저의 출현에는 레이저 변조를 위한 새로운 성능 체제와 통합 노력이 필요합니다."
2광자 현미경에 사용되는 가장 일반적인 AOM 물질은 이산화텔루륨(TeO2). 이 소재는 넓은 파장 범위에 걸쳐 탁월한 회절 효율과 높은 출력 처리 성능을 보여줍니다. 최대 전송 효율은 30dBm 정도의 적당한 RF 전력으로 달성됩니다.
테오2AOM은 일반적으로 1차에 최고의 회절 효율을 제공하고 더 높은 차수가 파괴적으로 소멸되는 브래그 상호작용 방식으로 구성됩니다. 최소한의 RF 전력 수준으로 높은 효율을 달성하려면 1cm 이상의 결정 길이가 필요하므로 무시할 수 없는 그룹 지연 분산(GDD)이 발생합니다. 다른 다운스트림 광학 장치, 특히 대물 렌즈의 분산도 고려하면 AOM 기반 현미경 시스템은 샘플 평면에서 가장 짧은 펄스를 유지하기 위해 분산 사전 보상 기능이 장착된 레이저와 결합함으로써 이점을 얻을 수 있습니다.
조정 가능한 레이저용 AOM을 배포하려면 신중한 광학 및 제어 전자 장치 설계가 필요합니다. 이격각(θS)는 RF 구동 주파수(즉, 격자 주기)와 레이저 파장에 따라 달라지므로, 레이저 파장을 튜닝할 때 포인팅 변화를 최소화하려면 RF 구동 주파수를 주의 깊게 보정해야 합니다. 또한 최대 회절 효율은 다양한 파장에 대한 다양한 RF 전력에서 달성됩니다. RF 주파수와 전력을 신중하게 제어하고 조정 가능한 이미징 시스템에서 상대적으로 큰 GVD를 관리해야 하는 필요성으로 인해 발생하는 더욱 번거로운 통합 노력으로 인해 뛰어난 성능 특성에도 불구하고 지금까지 많은 주택 건설업체 및 맞춤형 설정에서 AOM 사용이 제한되었습니다.
광범위하게 조정 가능한 레이저의 변조
680 - 1300nm 정도이고 출력이 2W를 초과하는 단일 상자로 광범위하게 조정 가능한 레이저의 출현에는 레이저 변조를 위한 새로운 성능 체제와 통합 노력이 필요합니다.
일반적으로 사용되는 KD*P 포켈 셀은 고출력에서 열 블루밍 효과를 표시하며 이는 빔 포인팅, 빔 웨이스트 무결성 및 수명에 해롭습니다. 파장이 길수록 구동 전압과 대비 문제가 더 높아집니다. 탄탈산 리튬은 더 넓은 튜닝을 위한 실행 가능한 EOM 재료이지만 상업용 장치의 그룹 지연 분산은 분산 보상 레이저의 수정 가능한 범위보다 높기 때문에 펄스가 길어지고 피크 전력이 감소하여 효율적인 이미징에 해를 끼칩니다.
앞서 논의한 바와 같이, 잠재적인 비용 및 성능 이점에도 불구하고 AOM 기반 솔루션을 배포하려면 높은 수준의 광학 설계 및 전자 제어 전문 지식이 필요하며 종종 많은 바이오이미징 시설에서 쉽게 사용할 수 없습니다. 즉, AOM 솔루션은 일부 현미경 공급업체의 통합 솔루션으로 상업적으로 제공됩니다.
2017년에 바카라 카지노는 AOM 변조와 레이저 소스를 통합하는 턴키 솔루션이 사용자와 현미경 업계 모두에게 이익이 될 것임을 인식했습니다. 산업용 초고속 가공 레이저의 통합 AOM 솔루션에서 얻은 전문 지식을 바탕으로 바카라 카지노는 Chameleon Discovery Laser의 완전 통합 옵션인 총 출력 제어(TPC)를 개발했습니다.
전체 전력 제어, 사용 가능카멜레온 디스커버리 NX, 핸즈프리 자동화 패키지로 660nm~1320nm의 전체 옥타브 튜닝 범위에 걸쳐 고대비(>1000:1) 및 고속(<1μs 상승 시간) 변조를 제공합니다.
그림 3:Chameleon Discovery NX TPC 및 변조 후 일반적인 최대 출력 전력.
RF 주파수와 전력 교정 및 조정에 대한 모든 과세 요구사항은 레이저 내부에 프로그래밍되어 있으므로 사용자 또는 현미경 통합업체가 제공해야 하는 모든 것은 설정된 파장과 필요한 전력 수준입니다.
AOM은 매우 비용 효과적이므로 Chameleon Discovery NX TPC의 고정 파장 1040nm 출력에는 자체 전용 AOM 및 드라이버도 장착되어 있습니다.
직렬/USB 명령 또는 빠른 아날로그 제어 입력을 통해 전원을 편리하게 제어할 수 있습니다.
그림 4:제공된 GUI를 사용하여 출력 전력을 직접 변경할 수 있습니다.
또는 사용자가 플라이백 블랭킹을 위해 추가 고속 아날로그 입력을 제공할 수 있습니다.
그리고 빠른 디더링 제어.
미래 동향
2광자 이미징 기술의 범위가 OEM 및 전임상 응용 분야로 확대됨에 따라 단일 파장, 비용 효과적인 펨토초 소스에 대한 수요가 증가하고 있습니다.축삭 계열소형 초고속 소스는 이러한 요구 사항을 완벽하게 충족합니다.
제품 개념 단계부터 TPC 기능이 Axon 설계에 통합되어 새로운 현미경 설계 및 애플리케이션에 대한 배포를 단순화했습니다. 이는 2광자 현미경 시스템이 순수한 연구 장비가 아닌 이동식 진단, 임상 또는 고처리량 스크리닝 장치의 일부인 응용 분야에 최고의 통합 편의성을 제공합니다.
첨단 신경과학 연구에서 고출력 레이저는 광유전학적 자극을 사용하는 전광학 생체 내 이미징 기술에서 핵심적인 역할을 하고 있습니다(Yuste, 2012). 수십 와트의 레이저 출력이 공간 광 변조기(SLM)를 통해 수십 또는 수백 개의 뉴런을 개별적으로 처리할 수 있는 개별 빔렛으로 분할됩니다. 이 광학 제어 방법에는 짧고 조정 가능한 펄스 버스트가 필요합니다. 다음과 같은 고출력 광섬유 레이저일관된 모나코모든 광섬유 설계 형식 덕분에 이러한 응용 분야에서 요구되는 유연성을 제공합니다. 결과적으로 높은 평균 출력, 고에너지 레이저 요구 사항 및 밀리초 미만의 시간 단위로 자극 빔을 전환해야 하는 필요성은 기존 Pockels 셀 기술에 대한 특정 과제를 제시합니다. 이를 위해 절묘한 펄스 제어, 단순화된 현미경 설계 및 향상된 이미징 시스템 신뢰성을 위해 AOM 기술이 Monaco에 완전히 통합되었습니다.
그림 5:Discovery TPC를 통해 구현된 고대비, 빠른 프레임 속도 칼슘 이미징의 예입니다. (1100nm(빨간색)에서 여기된 RCaMP1.07을 표현하는 뉴런과 940nm(녹색)에서 여기된 GCaMP6s를 표현하는 성상교세포의 오버레이, 생체 내, 마우스. 여기 소스 Chameleon Discovery TPC. 그림 출처 취리히 대학교 Weber Lab).
그림 6:모든 Axon 레이저는 공통 폼 팩터 내에서 옵션으로 TPC 기능을 제공합니다.
그림 7:Chameleon Discovery NX TPC가 Axon 920 TPC와 파트너십을 맺었습니다. TPC는 단순화된 광학 레이아웃을 구현하고 귀중한 테이블 공간을 절약합니다. 사진 제공: Neil Merovitch, 토론토 아픈 아동 병원.
요약
이 기술 노트에서 우리는 2광자 현미경에 사용되는 펨토초 레이저의 레이저 출력을 변조하는 두 가지 주요 접근 방식인 전기 광학 및 음향 광학 변조에 대해 논의했습니다. 대부분의 "주택 건축업자"는 광학 경로에 이 고전압 구동 장치를 배치하는 상대적 단순성 때문에 지금까지 EOM을 선택했습니다. 다양한 현미경 공급업체는 레이저 전달 트레인에 부분적으로 통합된 EOM 또는 AOM을 제공하며 소프트웨어 아키텍처는 현미경과 레이저를 모두 제어합니다. 바카라 카지노는 연중무휴 제조 환경을 위해 설계된 고출력 광섬유 레이저에 대한 제조 경험을 활용하여 크기, 비용, 속도 및 전체 성능 측면에서 AOM 접근 방식의 장점이 2광자 이미징 응용 분야에도 적합하다는 점을 인식했습니다. 레이저 소프트웨어 및 하드웨어 아키텍처 내에서 AOM의 정교한 제어를 통합함으로써디스커버리 NX, 축삭그리고모나코,2광자 사용자(주택 건축업체 및 스코프 회사 모두)는 고급 신경과학부터 의료 진단에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 광학 설정을 크게 단순화하고 제어하기 쉬운 이점을 누릴 수 있습니다.