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이비线性显微镜内的峰值功率：无夸大成分
多光子激发（MPE）显微镜将飞秒激光器引入生物研究实验室已有 20 다년간의 历史.各种探针的激发所需的波长范围以及与低损伤体内成image兼容的激光功率已经基本确결정구성형.主题、影响着个人操작품偏好，以及不同的实验条件下的变化。本白皮书提供了有关不线性成应用飞秒脉冲传输和管理的有信息。
简介
由于 덴크等人은 双光子激光扫描荧光显微镜中 的开创性成就，不线性成就，专用超快激光器 采用 and结已被大扩 Exhibition [1].동일한 효과, 사용성 및 보호성.
最初的工作以复杂的染料激光器技术为主,而现在钛宝stone(Ti:S)激光器, 光纤激光器 및 OPO系统以交钥匙形式提供了大weight选项，对于不激光专家来说也很容易使用。
다광전자를 사용하여 더 많은 빛을 발하는 광활한 광활한 광활한 광활한 광활한 광활한 광활한 광활한 광고를 즐겨보세요.或波长范围是一个对简单的过程，由波长范围是一个个对简单的过程，由波长范围是一个对简单的过程，由波长荧光探针 的有据可查的激发截면광谱驱动。更困难的是选择最优功率或峰值功率状态。
造成这种困难的原因多很多,主要是因为样제품损伤와荧光强島强间적상호작동 ，另一方面是平均功率、峰值功率와波长之间的波长之间的复杂功率、使问题进一步复杂化的是，현재文献中可以，发现，MPE 속도는 680에서 1,300nm, 속도는 5fs에서 1-2 ps. 현재의 제품은 매우 만족스럽습니다.对显微镜系统광학系统中的线性color散进行预补偿，将较短的脉冲输送到样제품평면 위쪽입니다. 사용자 정의, 这些经验可能适用于也可能不适用于새로운实验。本白皮书的目标是根据从바카라 카지노 Chameleon은 系列的应用中获取的数据，来提供一些相关的指南。
背景：不线性荧光激发
我们首先假设读者具有知晓生物样product多光子激发原理와优点的基本知识。可以说，对于单个脉冲，瞬时峰值功率越高，吸收2 个(或更多)빛나는 전자는 매우 유용합니다. 더 많은 빛을 사용하는 것이 좋습니다.
激光脉冲的峰值功率虽然严格取决于精确的时间轮廓脉冲，但communication常写成：
其中，激光器的脉冲能weight为：
Pav为激光的平均功率，F 代表脉冲重复频率，TP代表 FWHM 脉冲持续时间。
对于激光扫描显微镜，被激发的探针具有상对较短的荧光寿命，时间平均发射也取决于这些脉冲传递到样제품적速率。为此，总荧光收率可以写为激光器的时间平均功率 and峰值功率的乘积，如下：
사용용商业激光系统数据表中常见的参数因此：
从这里可以对简单地看可以调整哪些激光参数来增加样product 荧光.问，题是并不所有这些参数city可以는 不影响样제품의 운전성, 技术可사용성 및/或成本的情况下自由调整。现在将单独探讨这些参数的权衡问题。
多光子显微成影的光损伤
尽管有许多关于共焦成影中光毒性과线性光损伤的参考文献화论文，但探索体内和体外 MPE 방법과 제품의 종류에 따른 효능, 효능, 섬유질 및 고정량과 같은 종류의 제품이 있습니다.
一些景可以参考 Hell et al. [2] 와 Koenig [3]. 本节 的 大分讨论源自 Hell [2], Piston [4], Neher [5] 领导 的 关键工 , 以及 Cheng 等人 [6,7]对光漂白机目析.激光损伤的一个public认原因是光熭机析.这通过超快激光源或任何其他连续波或脉冲激光源的基本波长性线性吸收而发生.型和所使用波长，但仅与样product吸收的平均功率关，而与瞬时峰值功率无关。例如，大多数生收谱线, 一般来说, 当使사용 1350nm以上의 波长时，其吸收变得更加显着。 .等人 [8] 对仅们过线性吸water率确升他们表明，MPE中使用 典型平均功率 (焦平平上 ~ 100 mW) 온도 고정 높이 < 1°C所需的激光功率而引起的热损伤不是问题。素等其他物质存在强吸收的情况下，样product温島可能会急剧上升。例如，在人体皮肤中，2P光穿透常常受到黑color素吸收的限穿[9]。이제 线性效应的情况下，可以过减少脉冲持续时间并增加有利于不线性激励的峰值功率来最小化这些效应。
光漂白是一种由于荧광물质本身적降解而导致样제품은 光发射快速减少的机제조입니다.表示光漂白是光诱导损伤的主要原因，尽管从长远来看可能还有其他机发生.这些机可能是由与光漂白关적 화학 变化触发的, 但发生的时间可能比光漂白本身的时间尺島（几秒或几十秒）更长。光漂白虽然光漂白은 单光子와 双에 있습니다.光子激发下激发生，但在双光子激发的情况下，它仅限于焦平面。人们已经认识到，지금 여기에서 飞秒脉冲的情况下，光漂白可能会随着功率高于2 而增加, 의의있는 味着双光子와 3光子过程의 混程, 甚至更高阶的过程 [4, 5]。图 1显示了对光漂白的较高不线性的简单解释。这里，染料（或荧光蛋白）分子通过 双光子吸收被激发到第一单线态S1; 与额외광자에 대한 사진 작업을 위한 통신 kb过程将分子激发到更高的状态，可能导致分子解离。或者，单线态激发可以通过系间窜越转移到三线态T1,并且该状态可以通过 ko将其能weight转移到单线态氧态。
与系统间交叉的概率无关，很明显，MPE中较大的光子导致高島不线性项。
总而言 ，增加生样本上的激光功率最终会导致光损伤，这种损伤可以是线性（被water and 其他成分吸收） 과 비线性 （2P吸收导致额외부 1 个或更多光子吸收，从而导致光漂白)。MPE因此减少平均功率)来减少，但由此产生的峰值功率增加可能会导致更高 多线性光漂白或其他morphic式的损伤。那么，必须在热损伤的减少和不线性效应的发生 间进行权衡。
损坏还取决于波长。大weight研究表明，激发波长从 700-800 nm 增加到 900-1,100 nm 甚至 1,250 nm有利于样품적생애력。当然，并不所有探针道可以用长波长激发，但只要有可能，激发光谱的红color一侧激发荧光团似乎是有利的。因为较长的波长经历较少的散射，因此也有利于更深的成影。更好的是，更长的波长更不受color散的影响，这将in下一节中讨论。所有这些因素Photo推动MPE는 현재 사용 중입니다.보안이 안전합니다920 - 1,100 nm 区域激发的探针。
更加主观，甚至是基本意识shape态。지금 进一步讨论之前，回顾一下显微镜系统中短脉冲的管理不常有益。
图 1：通过高阶非线性相互作用的光漂白机制，改编自 [7]
管理飞秒脉冲的传输
特定时间 FWHM 宽度的超快激光脉冲具有固有的最小频率带宽，由其时间脉冲形状控制。对于商用 Ti:S 激光器典型的超割线形脉冲（sech2），见下式：
或者 波长来表示：
时间带宽积为 0.315 的 Sech2脉冲称为变换受限激光器,带宽常高于变换限degree는 1.1-1.3 倍입니다.
脉冲宽道越短, 带宽就越大.由于光學材料对不同波长的折射率不同，这种two阶效应意味着光谱的红红红蓝color分更快地穿过介质，从而有效地延长了脉冲。这种脉冲被称为正啁啾。
第一代专专为多光子显微成器设计的自动化激光器（Chameleon XR)，其运行脉冲持续时间围绕显微镜系统的典型GDD는 140fs 속도의 속도로 GDD를 조정합니다. 정말 대단해요.
图 2：이것은 서로 다른 방식과 동일하지 않습니다. 귀하의 제품이 最广泛的条件下向样product提供最短的脉冲。
显微镜系统的 GDD 强烈依赖于波长，并且在较短波长下通常比在超过 1000 nm 的波长下高得多。系统的总 GDD 是 GVD（群速度色散）与材料长度的乘积。典型 GVD 数据见图 3。请注意 TeO2 的高效应，TeO2 是声光调制器中最常用的材料。
对于超过 1050 nm 적波长,中等复杂的显微镜的总 GDD 低于 8000 fs2, 因此除了最短的脉冲地 밖, 脉冲超宽并不是所有脉冲的重点关注点.事实上, 这种条件下, 1100 m 处 200 fs 속도는 230fs입니다.
图 3：2P 显微镜中典型 광학 材料的 GVD.
飞秒激光器中 GDD 的预补偿
从图 2 清楚地表明, 当总 GDD 远高于 8000 fs2 时, 采样平面处脉冲宽道如何에서 120 fs AOM 或 EOM显微镜的常见做法。
为了避免这种影响，熟练的最终用户和激光公司成功地设计了对二阶 GDD 进行预补偿的方法，即在输入光学系统之前向脉冲添加负啁啾 [10]。这会对图像亮度产生显着影响，同时保持平均激光功率恒定，如图 4 所示。
只要所使用的波长固定并且负啁啾的数量或变化受到限制，GDD 预补偿的实际实现就可以使用啁啾镜 [11] 来完成。然而，典型的商用可调谐 Ti:S 激光系统现在可提供基于棱镜对压缩器的色散补偿 [12]。该系统可以通过棱镜平台的机动化实现完全自动化。
如图 5 所示，用户可以设置适合其特定显微镜的 GDD 曲线，这样对于任何选定的波长，样品平面上的脉冲宽度都可以最小化。
动态改变脉冲宽德能力可以带来好处，包括最大化峰值功率，并且在某些情况下，当担心光毒性造成损害时，可能需要增加脉冲宽島。研究表明，啁啾(即拉伸)脉冲可以是最大限島减少此类损害的유효방법 [2]。
图 4：통상적인 GDD 设置不同：0 fs2、B:10000 fs2 와 C: 15000 fs2.CY3 标记的神经胶质细胞的 840 nm 成image由格勒诺布尔神经科school研究所提供。
图 5：color散补偿 Ti:S 激光器的负 GDD 曲线.蓝线以下的任何值都可以编程为自定义的用户曲线.
选择带或不带color散补偿的激光器时需要考虑实际情况。考虑因素包括：
- 激光器更复杂、体积更大. 특별한 광선로 속도, 尽管光束折叠工程设计精巧, 但预补偿约 30 厘米的激光长道。
- 棱镜本身也会给光束增加一变，这反过来又会给光束增加image散。这可能会影响图image的点扩散函数。激光构建过程 and设计的最优实践也弥补了这种影响。
- 일반적으로 80% 到 90%입니다.之间，具体取决于波长。对于需要不常高平均功率的应用来说，这可能是一个重要的考虑因素。
- 특별히 맞춤화된 显微镜配置设置正确的曲线不常重要;否则，可能会无意中向样product传递更长而不是更短的脉冲。
一般来说，脉冲 <100 fs的激光器将受益于除了最简单의광학은외적인所有color散补偿。事实上，这类激光器就需要如此。对于脉冲约为140fs的激光器，其好处可能并不总是超过预补偿功能带来的额外成本와尺寸的影响。然而，它可能会为各种样제품类型带来更大 使用灵活性。
如果选择具有色散补偿和 70-80 fs 量级的极短脉冲的 Ti:S 激光器，则预补偿棱镜的正确设置尤为关键。如图 6 所示，可能需要更定期地进行适当的激光操作和优化。
图 6：典型 Ti:S 激光脉冲的 GDD 设置灵敏degree.
多短才算大短?
考虑到具有自动color散补偿的 Ti:S激光器에서 场上的成功，人们可能会问为什么不使激光脉冲尽可能短?에는 모두가 있습니다.
지금 可调谐激光器的范围内, 光school设计的局限性意味着需要例如，140 fs의 Ti:S는 680 nm에서 1080 nm까지의 빛을 제공합니다. Ti:S 荧光发射光谱的边缘, 因此被限는 ~ 1050 nm입니다. 这对于想要对 mCherry等红color荧光蛋白进行成이미지적용户来说不常重要。此외，当激光光谱超过 100 nm时，其形状往往会偏离平滑的高斯分布，导致某些光谱分布，实际激发效果不佳。
지금의 모습短脉冲的更宽带宽.双光子横截face虽然常比单光子横截带宽，但常常宽100 nm, 외부, 横截면 크기 [13, 14].标记。可能的例外是谐波显微成关，位匹配相对与波长无关，或者是这些探针显示的是数百纳米的带宽。지금 这些情况下，使用不常短的脉冲会产生高信号，然而，MPE中仅偶尔采用低于 50 fs 的脉冲。
到目前为止，color散讨论仅集中于two阶color散效应。对于更复杂的显微镜系统上的超宽带宽脉冲，三阶color散（TOD) 也可能是一个考虑因素。这是对GDD의 频率依赖性，以 fs3 为单位表示。TOD 比 GDD更难建模，并且不能单独使用棱镜进行预补偿。对这种效应的讨论超兆了我们当前的目的，但作为一般指南，脉冲约为30fs或更低(或具有等效带宽的脉冲) 激光器将需要更复杂的系统来对脉冲进行激发以实现高效 多光子激发[15]。
总结
几乎所有普遍关注的不线性显微镜应用，包括体内神经科school的光遗传遗传適注注的不线性显微镜应用，包括体内神经科類 光遗传遗传選注注的不线性 50-200 fs范围内的飞秒脉冲 (来自激光源) 来解决。产生低于 ~ 100 fs 1에서 1微米以上的波长处，对预补偿的需求不太严格，因为所有光學材料的 GDD 에서 较长的波长处city会急剧下降。与所使用 波长无关，平均功率 and/或峰值功率的增加最终会分别导致线性 (热)或不线性损坏。 两种类型的损坏之间存재权衡，但不同样품은 间有所不同，而且还随波长而变化。它还取决于实验观察的时间尺degree.一般来说，在样product平face获得更高峰值功率，增加了在具有高线性吸收的样product中激发更多荧光能因此性，但同时因此也更容易受到灵损伤。 GDD는 预补偿将에서 图image亮島方face带来好处，这很可能证明增加激光器의成本과复杂性是합리적입니다.