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Die Herausforderung

Jessica Houston an der New Mexico State University 교수의 Forschungsgruppe von 교수 untersucht die einzigartigen Möglichkeiten, die zeitaufgelöste Messungen in derDurchflusszytometrie비텐. Ein wichtiger Schwerpunkt der Gruppe ist die Kartierung des Stoffwechsels von Krebszellen – die Bewertung ihrer Vitalität – in Gegenwart von Chemotherapeutika unter Verwendung von Messungen der Fluoreszenzlebensdauer. Eine weitere wichtige Anwendung zielt auf die grundlegende Zellsignalisierung und Rezeptoraktivität ab, wobei Förster-(Fluoreszenz-)Resonanzenergietransfer(FRET) und Fluoreszenz Proteine verwendet werden.

Houston stellt fest, dass sich die zeitaufgelöste Durchflusszytometrie deutlich von den meisten bestehenden Durchflusszytometrie-Anwendungen unterscheidet, die sich auf Daten zur Fluoreszenzintensität im stationären Zustand verlassen, 음 Zähl- und Sortierfunktionen auszuführen. Und die handelsüblichen Durchflusszytometer, die für stationäre Daten optimiert sind, eignen sich nicht für ihre Forschung. Als ersten Schritt musste ihre Gruppe also ihr eigenes Durchflusszytometer bauen.

Es gibt zwei bekannte Methoden zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern: im Zeitbereich unter Verwendung eines gepulsten Lasers oder einer anderen Lichtquelle oder im Frequenzbereich. 휴스턴 직원: „Wir brauchen ein Durchflusszytometer mit hohem Durchsatz, um große Zellpopulationen zerstörungsfrei zu zählen und/oder zu sortieren, z. B. um Metastasierende Krebszellen im Blut zu untersuchen. Und Messungen im Zeitbereich mittels Photonenzählung würden den erforderlichen Durchsatz nicht ermöglichen. Daher haben wir uns entschieden, im Frequenzbereich zu arbeiten, wo die etablierte Methode darin besteht, eine Modulation auf den Anregungslaser anzuwenden und die beobachtete Phasenverschiebung in der modulierten Fluoreszenzemission zu korrelieren.“

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Die Gruppe in Houston wollte die Möglichkeit haben, zusätzlich zur Untersuchung der endogenen Fluoreszenz von Metaboliten wie NADH und FAD eine Vielzahl verschiedener Fluorophore in ihrer Arbeit zu verwenden. Sie benötigten also mehrere Laserwellenlängen, um all diese verschiedenen Ziele effizient anzuregen. Außerdem brauchten sie Laser mit einer Guten Modenqualität, d. 시간. mit einem niedrigen M2-Wert, sowie mit einer hohen Stabilität der Leistung, sowohl in Bezug auf die Strahlführung als auch auf das Leistungsrauschen.

Nach sorgfältiger Prüfung entschieden sie sich für die OBIS-Laser von 바카라 카지노. 휴스턴의 설명: "Wir haben derzeit mehrere OBIS-Laser mit Wellenlängen von 375 nm, 405 nm, 488 nm 및 633 nm. Diese Intellitenten Laser sind perfekt für unsere Arbeit. Zusätzlich zu ihrer hochwertigen Leistung unterstützen sie die schnelle 디지털 변조, die wir für unsere Arbeit benötigen, und es ist so einfach, diese Plug & Play-Laser, die alle die gleiche Form und Größe haben, hinzuzufügen und zu entfernen." Sie merkt an, dass die Verfügbarkeit von 10er und sogar 100er Milliwatt ein weiteres wichtiges Merkmal von OBIS ist. Das liegt daran, dass viele ihrer Experimente auf Lebensdauermessungen im Frequenzbereich beruhen, bei denen die digitale Modulation die Laserleistung an der Fließzelle um 50% reduziert

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Houston erklärt, dass sich ihr speziell angefertigtes Durchflusszytometer und ihre wachsende Sammlung von OBIS-Lasern als erfolgreiche Kombination erwiesen haben und bereits zahlreiche Daten sowohl für ihre Studien zum Metabolischen Profiling als auch für die FRET-Arbeiten geliefert haben.

Für die Erstellung von Stoffwechselprofilen führt sie das Beispiel von NADH an, bei dem die gemessene Fluoreszenzlebensdauer davon abhängt, ob dieser Metabolit in der untersuchten Zelle hauptsächlich in gebundenem oder ungebundenem Zustand vorliegt. Zelle ATP erzeugt, das Energiemolekül, das den Großteil der zellulären Aktivitäten antreibt가 필요합니다. Stoffwechselaktivitäten in Normalen Zellen beruhen in erster Linie auf der oxyativen Phosphorylierung(OXPHOS) in den Mitochondrien, um ATP zu erzeugen. Bei vielen Arten von Krebszellen spielt die Glykolyse jedoch eine größere Rolle bei der ATP-Produktion, und die OXPHOS-Kapazität ist reduziert. 따라서 Houston-Gruppe die NADH-Lebensdauer als Quantumn Maßstab dafür verwenden, wie die Zellen beispielsweise auf neue Behandlungen reagieren.

Die Gruppe nutzt das System auch für die schnelle Erfassung 정량적 FRET-Daten. Sie analyzesieren diese Daten, um Protein-Protein-Wechselwirkungen besser zu verstehen, um die Konformation von Proteinen zu stutieren und um die Wirkung von Enzymen zu untersuchen. 휴스턴 merkt an: "Wir können zum Beispiel feststellen, ob sich ein Donor-Fluorophor in einem gelöschten Zustand befindet oder nicht. Wir können auch sowohlSpenderals auch Empfängeremissionen erfassen. Auch diese Daten können einen Hinweis auf die Wirksamkeit von Krebstherapien geben. Unterm Strich liefern die OBIS-Laser und unser Hochdurchsatz-Zytometer wirklich eine Fülle von Daten.“

참조:

1. J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin 및 J. P. Houston, "온칩 음향 집속형 형광 수명 유세포 분석기의 개발을 향하여", Frontiers in Physics, 2021 9:253 
2. A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino 및 J. P. Houston, "세포 및 조직의 형광 수명 감지를 위해 설계된 새로운 고처리량 방법에 대한 검토," Frontiers in Physics, 2021 9:163 
3. K. Nichani, J. Li, M. Suzuki 및 J. P. Houston, "형광 수명 기반 세포 계측법 측정 및 페이저 분석을 통한 세포사멸 중 카스파제-3 활성 평가", Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275;  
4. F. Alturkistany, K. Nicani, K. D. Houston 및 J. P. Houston, "시간 분해 유동 세포측정법으로 측정한 세포사멸 중 NAD(P)H의 형광 수명 이동", Cytometry A 2019; 95(1):70-79  

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