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도전

뉴멕시코 주립대학교 제시카 휴스턴 교수의 연구 그룹은 시간 분해 측정을 사용할 수 있는 독특한 방법을 조사합니다.유세포분석.그룹이 중점을 두는 중요한 영역은 형광 수명 측정을 사용하여 화학요법제가 있는 상태에서 암세포의 활력을 평가하는 대사 매핑입니다. 또 다른 주요 응용 분야는 Förster(형광) 공명 에너지 전달(FRET) 및 형광 단백질을 사용하여 기본적인 세포 신호 전달 및 수용체 활동을 목표로 합니다.

Houston은 시간 분해 유세포 분석이 계산 및 분류 기능을 수행하기 위해 정상 상태 형광 강도 데이터에 의존하는 대부분의 기존 유세포 분석 응용 프로그램과 분명히 다르다는 점을 지적합니다. 그리고 정상 상태 데이터에 최적화된 시중에서 판매되는 유세포 분석기는 그녀의 연구에 적합하지 않습니다. 따라서 첫 번째 단계로 그녀의 그룹은 자체 유세포 분석기를 구축해야 했습니다.

형광 수명을 측정하는 두 가지 잘 알려진 방법은 펄스 레이저나 기타 광원을 사용하는 시간 영역 또는 주파수 영역입니다. Houston은 "예를 들어 혈액 내 전이성 암세포를 연구하기 위해 대량의 세포 집단을 비파괴적으로 계산 및/또는 분류하려면 높은 처리량의 유세포 분석기가 필요합니다. 그리고 광자 계산을 사용한 시간 영역 측정은 필요한 처리량을 지원하지 않습니다. 그래서 우리는 여기 레이저에 변조를 적용하고 변조된 형광 방출에서 관찰된 위상 변화를 상호 연관시키는 확립된 방법인 주파수 영역에서 작업하기로 결정했습니다."

해결책

휴스턴 그룹은 NADH 및 FAD와 같은 대사산물의 내인성 형광을 관찰하는 것 외에도 작업에 다양한 형광단을 사용할 수 있는 기능을 원했습니다. 따라서 서로 다른 모든 표적을 효율적으로 자극하려면 여러 레이저 파장이 필요했습니다. 또한 빔 포인팅 및 전력 노이즈 측면에서 우수한 모드 품질, 즉 낮은 M2와 높은 안정성 출력을 갖춘 레이저가 필요했습니다.

신중한 평가 끝에 그들은 바카라 카지노의 OBIS 레이저를 사용하기로 결정했습니다. Houston은 "우리는 현재 375 nm, 405 nm, 488 nm 및 633 nm를 포함한 파장의 여러 OBIS 레이저를 보유하고 있습니다. 이러한 스마트 레이저는 우리 작업에 완벽합니다. 고품질 출력 외에도 작업에 필요한 빠른 직접 디지털 변조를 지원하며 모두 동일한 형태와 맞춤을 갖는 플러그 앤 플레이 레이저를 추가하고 제거하기가 매우 쉽습니다."라고 말합니다. 그녀는 10~100밀리와트의 가용성이 또 다른 중요한 OBIS 기능이라고 지적합니다. 이는 그녀의 실험 중 상당수가 디지털 변조가 본질적으로 플로우 셀의 레이저 출력을 50%까지 떨어뜨리는 주파수 영역 수명 측정을 기반으로 하기 때문입니다.

결과

휴스턴은 맞춤형 유세포 분석기와 늘어나는 OBIS 레이저 컬렉션이 성공적인 조합임이 입증되었으며 이미 대사 프로파일링 연구와 FRET 작업 모두에 대해 많은 데이터를 제공했다고 말합니다.

대사 프로파일링을 위해 그녀는 측정된 형광 수명이 이 대사산물이 평가 중인 세포에서 주로 결합 상태인지, 결합되지 않은 상태인지에 따라 달라지는 NADH의 예를 인용합니다. 이는 세포가 대부분의 세포 활동에 힘을 실어주는 에너지 분자인 ATP를 생성하는 방식과 관련이 있습니다. 정상 세포의 대사 활동은 주로 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS)에 의존하여 ATP를 생성합니다. 그러나 많은 유형의 암세포에서 해당과정은 ATP 생산에 더 큰 역할을 하며 OXPHOS 용량은 감소합니다. 따라서 휴스턴 그룹은 예를 들어 세포가 새로운 치료법에 어떻게 반응하는지에 대한 정량적 측정 기준으로 NADH 수명을 사용할 수 있습니다.

또한 그룹은 정량적 FRET 데이터를 빠르게 수집하기 위해 시스템을 사용하고 있습니다. 그들은 단백질-단백질 상호작용을 더 잘 이해하고, 단백질 구조 연구를 위해, 그리고 효소 작용을 조사하기 위해 이 데이터를 분석하고 있습니다. Houston은 "우리는 기증자 형광단이 냉각된 상태인지 아닌지와 같은 것을 볼 수 있습니다. 또한 기증자 방출과 수용체 방출을 모두 캡처할 수 있습니다. 다시 말하지만, 이 데이터는 암 치료법의 효과를 나타낼 수 있습니다. 결론적으로, OBIS 레이저와 당사의 고처리량 세포측정기는 실제로 풍부한 데이터를 제공하고 있습니다."

참조:

1. J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin 및 J. P. Houston, "온칩 음향 집속형 형광 수명 유세포 분석기 개발을 향하여", Frontiers in Physics, 2021 9:253
2. A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino 및 J. P. Houston, "세포 및 조직의 형광 수명 감지를 위해 설계된 새로운 고처리량 방법에 대한 검토", Frontiers in Physics, 2021 9:163
3. K. Nichani, J. Li, M. Suzuki 및 J. P. Houston, "형광 수명 기반 세포 계측법 측정 및 페이저 분석을 통한 세포사멸 중 카스파제-3 활성 평가", Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275;  
4. F. Alturkistany, K. Nicani, K. D. Houston 및 J. P. Houston, "시간 분해 유동 세포측정법으로 측정한 세포사멸 중 NAD(P)H의 형광 수명 이동", Cytometry A 2019; 95(1):70-79 

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