文章
与时俱进的高分辨率多波长 3D 成人
采用激光荧光技术的创新型扫描共聚焦平face激发 (SCAPE) 显微镜
克服早期法的局限性并提供广泛的生命科途途。
综述
生命科school不同领域的研究人员对3D 荧光显微镜工具같은 종류의 需求，这些显微镜拥有高速、高image素数와单细胞分辨率的特点，并且可以는 不对样제품造成显著光损伤的情况下获取图image.但是，尽管已经取得了巨大的发进및技术改进，但大多数成熟技术仍然需要权衡，不可避免地妥协其中至少一个参数。
图 1：SCAPE 中에서 使使用线轮廓光束对主显微镜물镜进行离轴 사진, 以倾斜角도형 모양의 성광 사진 (a);SCAPE过扫描该光该来构建体积图이미지, 같은 时捕获所射平face 一系列图이미지 (b)。
进步与权衡
例如,由于물리扫描单个光斑时的速道限章，共聚焦显微分析无法에서 变频重复频率下以高分辨率对大 xyz体积进行成image。此外，每个image素的停留时间很短，这意味着最快的共聚焦扫描需要高激光功率，从而对活样product造成严对损伤。
虽然双光子显微成영상可显著减轻光损伤，但这种单点방법면临着俑开发的快速声光调器는 着近开发의 快速声光调器과 유사하다. (AOM) 可以更快地扫描预先选择的小体积，但这种方法对于大体积或移动的生物体的用途有限。
传统光片照明显微镜可以同时对整个 xy 平面进行采样，但它需要横向取样（因此需要特殊准备），并需要时间才能构建 3D 数据立方体。此外，光学器件和载物台移动同步使这些技术复杂而缓慢。
哥伦比亚大school祖克曼大脑行为研究所 (Zuckerman Mind Brain Behavior Institute)(纽约州纽约市)의 Elizabeth Hillman教授와 她的同事着时支持各种 以期避开这些限种封装와 未封装의 各种 모양의 제품입니다. (SCAPE) 显微镜，该显微镜最初见诸于 2015년의 一篇출품물.12019년 报告了更新版本 SCAPE 2.0，2，Leica Microsystems 认识到其广泛的生命科school功用，现已获得该显微镜的使用许可。
SCAPE의 작업원리
힐먼解释说：“我们推断，单点甚至多点扫描可能永远也无法实现真正的高速成留。即使我们可以获得所需的扫描速島，但每个image素的停留时间太短，无法获得信噪比可接受的图图image。所以，我们开始考虑光分Illuminati显微镜。当时几乎所有系统city需要两个物镜， 在样product周围相互成90°입니다.
团队意识到，通成过高数值孔径使用离轴路径会实际 xy 平face 45° 각도 모양 모양의 레이저 사진(见图1)입니다.聚焦机。 3 힐먼 매우 유용한 제품은 최고의 제품입니다.使焦点保持는 移动의 광 사진 위에 있습니다. 3D 体积图이미지。
스케이프 2.0의 一些细节（见图2) 많은 정보가 있습니다.平面成图(即光分与查看轴之间成一定角titude)问题。然后通过第二个物镜捕获此图image，물镜以一定角titude（大约127°) 布置, 以将光聲평평면수평형聚焦到机上。
图 2：活动式校准镜是 SCAPE 2.0 的关键元件之一。
상상적인 最终图 Image 是样products内的倾斜 y-z 平face, 일반적인 常是矩형;方向（更对于 y）更窄。在此类样品中，操작동机仅读取更少的行数（对应于 z方向这可实现更高速島的成很很例如，可以은 1000에서 18,000fps로 700에서 200으로 속도가 빠릅니다.行，具体取决于使用体机。
通过使用多面镜来扫描光片，首次解决了扫描同步问题。检测路径包含与激发光使用的面相邻的面。Hillman 解释说：“这个多面镜是 SCAPE 的最初灵感来源，但我们很快意识到使用单个振镜将会更简单，并且同样有效。这一变化使系统制造起来更简单、更经济，可以让更多光线返回相机，并且更容易控制系统的扫描模式。”
除了振镜外没有其他移动部件，因此，SCAPE 的整体速度仅受相机帧速率和信噪比 (SNR) 的限制。根据具体实验，以 10 到 100 Hz 的频率扫描振镜，相当于前所未有的 10-100 体积/秒 (vps)。SCAPE 使用传统锯齿扫描模式，即线性扫描后进行准瞬时重置。振镜的扫描幅度和每次扫描的相机帧数决定了系统的视野和 x 方向的采样密度。可以利用更快的相机来提高体积速率、采样密度或视野。虽然团队的大部分成像都使用标准 sCMOS 相机，但他们使用带有集成增强器的超快 CMOS 相机实现了超过 300 vps 的成像。
由于扫描的光分与图image查看轴 z 최종 결정된 속도, 因此, 每个深島切pictures Photo 对于下一个切 Pictures均略有偏移。显微镜的计算机使用简单变换来纠正这种“倾斜”并生成无失真的3D 이미지체입니다.
数字激光调제
同时监测多个荧光团（包括功能指标和荧光蛋白）可以将动력학행为（例如肌肉动작）与分子组成、细胞结构、神经信号等相关联。SCAPE communications 插即용바카라 카지노 OBIS 光泵浦半导体激光器(OPSL)提供多波长激发，轻松支持此类应用，并可选择个上同时并排获取两个或多个光谱离的图image。
Hillman이 指출, 与早期의 激光类型 比,OPSL技术는 这项工작중의 几个创新优势입니다. 와功率级。"几年前，如果需要可用 功率级，我们可以使用488nm, 532nm 및 638 nm, 差不多仅此而已。이제黄光과橙光范围内,我们别无选择。但如今,我们可以” 굉장한 규모의 SCAPE系统道集成了多个自由空间激光器，为他们提供了比光纤耦更高 灵活性。"激光器结构紧凑，외형尺寸city完全便，电子接口也别无二致，使用起来不常方便。” Hillman은 说，迄今为止，他们에서 一些实验中已经使用了多达五种激光波长。她还解释说，她经常将 SCAPE带到研讨会와培训课程中，并使用可用的 OBIS 激光器，极少需要重新校准。
数字成像是 OPSL 激光器的另一个重要功能。由于 OPSL 激光器能以高达 25 kHz 的速度打开和关闭，因此，激发波长可以在精确定时的连续帧上交替。通过使用实验室构建的图像分割器（由二向色滤光片和滤光镜组成）进行多波长检测，可以对此功能进行补充。该设备可投射光谱分离的图像，视野宽达 1280 体素，与单波长操作相比，对成像速度没有影响。
전시작동화范围
最近的两项합작研究说明了 SCAPE 的能력과范围.
작은 생물체 형상(包括整个身体、大脑和神经系统)是神经科학적인 一个趋势。Hillman及其同事最近发表了一项研究，描述了他们对活果蝇幼虫中基因编码和钙敏感荧光蛋白的高速 3D 연예인 （见图3). 특별한 외부, 团队还跟踪了沿体壁分布的神经时变shape时的放电方式.
团队还使用 SCAPE 研究了活体啮齿动物脑皮层中神经元树突5 和小鼠鼻内嗅感觉神经元 6 的动态放电过程，并对自由移动的整个秀丽隐杆线虫蠕虫进行了成动。此外，他们还马鱼胚胎心脏跳动的戏剧性视频。2
통신发育，包括遗传和环境因素对结构影响。传统显微分析需要时间选为2 至 4Hz 적 정념况下, 这不可避免地会遗漏诸如不规则心律失常等细节, 并且它无法对红细胞 (RBC) 流动析执行全4D 颗粒跟踪.Hillman의 团队与작은心脏病학专가족 Kimara Targoff教授합작, 后저자적 实验室使用斑马鱼来破译可能导致胚胎心脏畸shape的基因突变.过他们以超过 100 vps GCaMP 标记捕获了整个心跳过程中钙活性的单独波shape (见图 4)。
图 3：由 SCAPE 2.0 以 10 vps 的速率捕获的这三幅移动果蝇幼虫图image中 [3]，용 GFP 488nm 488 nm激发进行了成彡。颜color（从黄color到蓝color）表示从不同深島进入样품의 信号。有关详细信息，请参见 R. Vaadia 等人的研究[4];유해한 정보가 있습니다. http://bit.ly/SCAPE2019。
图 4：此三联图image取自以 100 vps 的速率捕获的斑马鱼实时心跳视频。顶联板显示 z 投影，底显示x 投影。지금 连续的图image中，心室开始被压缩，流 out瓣打开，然后由心房充满。心脏壁的内皮细胞사용 EGFP(색상) 标记, 而红细胞사용 DsRed(색색) 标记.两个荧光团均용 488nm 激光激发(재매품상위功率为 0.6 mW).
总结
지금 整个生命科science领域,研究人员可以过荧光显微分析핸디캡, 细胞, 器官화생물체는 一起。与时俱进地记录高分辨率多color (3D) 가상 이미지 효과(4D 显微分析)现已准备好에서 加速此研究면发挥关键작동。
参考文献
参考文献
1. M. B. Bouchard 외, Nat. 포토닉스, 9, 2, 113–119 (2015).
2. V. Voleti 외, Nat. 방법, 16, 10, 1054–1062 (2019).
3. C. 던스비, 선택. 익스프레스, 16, 25, 20306–20316 (2008).
4. R. Vaadia 외, bioRxiv, 467274 (2018).
5. E. M. Hillman 외, 현재. 의견. 신경생물., 50, 190–200 (2018).
6. L. Xu 외, 과학, 368, 6487, eaaz5390(2020).