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삶의 속도에 적합 고해상도 다색 3D 간격
스 푸시 공초점 방향 좌측 여기(SCAPE) 카메라인 혁신적인 형광 형광 기술은
이전 방법의 경계를 극복하고 광범위한 과학 분야에 참여할 수 있습니다.
개요
다양한 과학 분야의 연구는 고속, 높은 범위 수 및 단일 세포 세포가 특징적이고 특정에 대한 광손상을 실험지 및 이미지를 획득할 수 있음3D 형광 현미경 도구를 처음으로 요청해 주세요. 수많은 개발과 기술이 개선되었으므로 대부분의 기술에는 고정된 개별 중 하나 이상에 타협하는 믿음이 수반됩니다.
그림 1: SCAPE에서 복잡한 광은 라인 약력을 이용한 기본 현미경 대물 렌즈의 축외 조명에 의해 비스한 각도로 형성됩니다(a). SCAPE는 특정 조명된 평면 이미지를 캡처하는 동안 개요광을 검색하여 체적 이미지를 존재합니다(b).
진행 상황과 불충안
예를 들어공초점 현미경은마일로 단일 지점을 검색하는 속도의 제한으로 인해 다중 헤르츠 반복률로 고해상도의 큰 xyz 볼륨을 이미지화할 수 없습니다. 반대당 고정 시간이 가장 빠른 공초점 스캔에서 헬리콥터 출력이 필요하며, 결과적으로 라이브 샘플에 머무는 동안 광상이 발생합니다.
이광자 현미경은 광손상을 내부는 하나, 이러한 단일 지점 접근 방식을 사용하다 보면 속도/해상도/체적 무상충점으로 같은 문제에 직면하게 됩니다. 더욱 확장된 확장형 확장 확장기(AOM)를 사용하여 미리 선택할 수 있는 소형 확장을 이제 더 빠른 확장할 수 있지만 이 접근 방식은 확장 가능한 확장형 확장형에 제한적으로 사용 가능합니다.
기존의 멋진 광 현미경으로 전체 xy 평면을 동시에 사용할 수 있지만, 3D 데이터큐브를 구축하기 위해 별도 샘플 접근(이에 따라 특별한 준비)과 시간이 필요합니다. 또한 광학과 운동의 논쟁으로 인해 이러한 기술이 제한하고 있다고 생각합니다.
컬럼 비아 대학 Zuckerman Mind Brain Behavior Institute(뉴욕주 뉴욕)의 Elizabeth Hillman 교수와 동료들이 장착 및 비장착 샘플 형상을 이와 같이 제한을 없애는 방식을 개발하기 시작했습니다. 2015년 간행물에서 처음 기술이 적용된 공초점 방향 대신 여기(SCAPE) 탐색기라는 결과를 더 이상으로 얻을 수 있습니다. 12019년에는 업데이트 버전이 SCAPE 2.0이 보고되고 있습니다,2Leica Microsystems는 광범위한 생명 과학 항공기를 탐지하여 보호했습니다.
SCAPE 작동 방식
Hillman은 다음과 같이 설명합니다. "우리는 속도가 매우 빠른 경우에 단일 또는 다중 캐리어 스캐닝 범위에서 특정 기능을 사용할 수 있습니다. 필요한 스캔을 얻을 수 있는 박쥐 줄기의 범위 시간은 내성이 있는 신호 시뮬레이션 대비로 이미지를 캡처하는 데 너무 짧습니다. 그래서 우리는 단순한 광화학에 대해 생각하기 시작했습니다. 그 거의 시스템에는 모든 사용된 샘플에 대해 90°로 배치된 두 대물 렌즈가 있습니다. 관련 문제는 가변형 광의 다중 활용도를 단일 대물 렌즈 구성에 결합할 수 있는지 여부가 여러 개 있습니다."
연구팀은 축외 위치를 사용하면 높은 위치의 반대쪽 대물렌즈의 끝을 통해 요리사의 실제 xy 망원경과 45°를 펼쳐 여기에서 광경을 만들 수 있다는 것을 알아낼 수 있습니다(그림 1 참조). 이 사면에서 장착 이미지를 화하기 위해 사면 현상과 나타나는 방식으로 대물렌즈의 패치를 회전하여 카메라를 초점을 맞추었습니다.3 Hillman과 그의 팀은 대물렌즈에 대한 스캐닝 미러를 사용하여 누드광을 사용하여 구성하고, 때문에 신기함이 있어 이동하는 광에 대해 유지합니다. 3D 볼륨의 이미지를 빠르고 반복적으로 생성할 수 있습니다.
SCAPE 2.0(그림 2 추천)의 장점 설명. 즉, 단위 축에 대해 어떤 각도를 조절하는 입체광)을 찾아내는 문제는 감지된 형광을 전달하는 두 번째 대물 렌즈로 소수점에서 실제 조정 이미지를 형성함으로써 처리됩니다. 다음 그런 비스듬히(약 127°로) 배열된 두 번째 대물 렌즈를 통해 이 이미지를 캡처하여 멋진 광경의 초점을 카메라에 올려서 편집합니다.
그림 2: 반전 거울은 SCOPE 2.0의 핵심 요소 중 하나입니다.
카메라의 최종 이미지는 샘플 내에서 비스듬한 yz 평면으로, 일반적으로 사용자 지정입니다. 대부분의 조직에 빛이 제한적으로 소품하기 때문에 z방향(y에 비해)이 더 많이 활동합니다. 이 실험에서는 훨씬 더 빠르게 회전할 수 있으므로 배치할 수 있는(z의 범위에 해당) 전용 카메라를 작동하도록 하는 것이 유용합니다. 예를 들어 사용하는 카메라에 따라 1,000~18,000fps에서 200행을 확장할 수 있습니다.
스캔 문제는 먼저 폴리곤 미러를 사용하여 드러나는 광을 스캔함으로써 만들어졌습니다. 육지에 있는 곳에는 여기 광에 의해 소유된 것 외에 다른 패시터가 포함되어 있습니다. Hillman은 다음과 같이 설명합니다. "이폴리곤 미러는 SCAPE에 대한 단일 검류계 미러를 사용하는 것이 더 간단하고 작동한다는 것을 즉시 인식했습니다. 이 변경 사항으로 인해 시스템을 더 쉽게 연결할 수 있게 만들 수 있고, 카메라에 더 많은 빛을 유지하고 시스템의 스캔 패턴을 더 쉽게 제어할 수 있습니다."
검류계 거울 먹이 부분이 그래서 SCAPE의 전체 속도는 카메라 프레임 속도와 신호 대 모델링비(SNR)에 만 크기로 제한됩니다. 특정 실험에 따라 검류계 미러는 10~100Hz에서 검색되고, 출력되지 않은 10~100vps(초당 볼륨)에 해당됩니다. SCAPE는 기존의 최고 니 검색 패턴, 더 많은 스위프 후 거의 유일하게 사용됩니다. 검류 계 스위프의 챔피언십과 스위프당 카메라 수 프레임은 x 방향에서 시스템이 무너지기를 결정합니다. 더 빠른 카메라를 활용하여 볼륨 속도를 높이고, 수익성을 높일 수 있습니다. 팀은 대부분의 카메라 표준 sCMOS를 사용했지만 통합 강화 장치가 있는 초고속 CMOS 카메라를 사용하여 300vps를 지원하여 인증받았습니다.
단면광이 이미지 보기 축 z에 비스듬히 좀비되기 때문에 각 영역 보호는 다음 보호를 기준으로 협상하는 것입니다. 선반의 컴퓨터는 이 '왜곡'을 수정하고 조정하지 않은 3D 이미지 볼륨을 생성하기 위해 간편 변환을 사용합니다.
디지털 차세대
기능 지표 및 형광 베타를 포함하여 다양한 형광단을 검증하면 거동(예: 근육 활동)과 부품 구성, 세포 구조, 신경 신호 등의 성공 관계를 증명할 수 있습니다. SCAPE는 플러그 앤 플레이바카라 카지노 OBIS 광여기 추억(OPSL)를 통해 다수 여기를 제공하고 카메라에서 두 개 이상의 스펙트럼으로 분리된 이미지를 동시에 획득할 수 있는 옵션을 제공하여 해당 응용 프로그램 영역을 지원합니다.
Hillman은 이전의 헬리콥터 유형과 비교하여 이 작업에서 광여기의 첨단 기술의 몇 가지 혁신적인 장점을 가지고 있습니다. 사용 가능하며 매우 넓은 규모의 범위에 주목합니다. "몇 년 전에 우리는 488nm, 532nm, 638nm를 가지고 있어서 사용 가능한 수준을 원하고 있다면 그것으로만 가능했습니다. 노란색과 범위 옵션이 규정습니다. 하지만 거기에는 일반적으로 사용 가능 거의 모든 형광단의 여기와 거의 일치하는 데서 맴돌고 밀리와트의 레이저 소스를 분리할 수 있습니다." Hillman은 대부분의 SCAPE 시스템이 다수의 자유 공간 우주를 통합하여 파이버 결합보다 더 많은 사용자를 제공한다고 설명합니다. “레이저가 성능은 모두 동일하며 폼 팩터와 동등한 전자 인터페이스를 가지고 있어서 매우 편리합니다.” 현재까지 Hillman은 일부 실험에서 최대 5개의 레이저를 사용했다고 합니다. 또한 SCAPE를 기록할 가능성이 있다고 설명합니다.
디지털은 광여기에 에너지의 또 다른 중요한 기능입니다. OPSL(광 여기저기 레이저)은 최대 25kHz의 속도로 벽돌 수 있기 때문에 보이지 않기 때문에 줄 프레임에서 여기에 있을 수 있습니다. 이는 이색 필터링 및 마이크로로 구성 실험실 구축 이미지를 스플리터를 사용하는 최대로 감지로 보완됩니다. 이 장치는 단독 작업과 경쟁하여 속도에 영향을 미치기 때문에 최대 1,280복셀룰러 스펙트럼으로 분리된 이미지를 사합니다.
출력 및 범위 시연
두 개의 최근 공동 연구는 SCAPE의 출력과 범위를 표시합니다.
몸 전체, 키 및 모든 것을 포함한 작은 개체의 활동은 신경과학의 추세입니다. Hillman과 동료들은 살아 있는 초파리 유충에서 관계를 맺은 최근에, 일부에 스포팅을 돕도록 3D 영상 촬영을 위해 노력하는 방법을 설명하는 연구를 발표했습니다. 팀은 캐스팅 크롤링 동안 유충의 몸과 몸체의 일부분을 포함하는 것 외에 체벽을 따라 변형된 부분이 어떻게 발화되는지 추적했습니다.
또한 팀은 SCAPE를 사용하여 살아있는 설치류 피질5의 수중돌기 및 스포츠 코에 있는 후각 배열6을 연구하고 움직이는 동적 예쁜꼬마선충 전체를 이미지화했습니다. 게다가 제브라피쉬 배아의 심장 박동에 대한 비디오를 제작했습니다.2
제브라피쉬 배아의 심장에 대한 연구는 조각적 및 적적 환경 요인 구조와 기능에 영향을 포함하여 척추동물의 심장박동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 원래의 실험실은 2~4Hz의 자연 심박수를 소수일 때 먼지한 이상한 맥과 같은 세부 사항을 다루기 때문에 시간 교환이 필요하며, 적혈구(RBC) 작은 분석을 위해 전체 4D 입자 추적을 수행할 수 없습니다. Hillman의 팀은 제브라피시를 사용하여 배아에서 심장 기형을 일부분 수 있는 유전적 돌연변이를 해결하는 연구실의 청소년 심장 전문의 Kimara Targoff 교수와 협력했습니다. 좋은 함께 100 vps 이상으로 심장이 아낄 때 적혈구의 작은을 동영상으로 촬영하고 GCaMP 필러를 활용해 심장이 아낄 때 많은 활동의 각 작은을 촬영했습니다(그림 4 참조).
그림 3:vps에서 SCAPE 2.0으로 캡처한 이동 초파리 유충의 이세 이미지에서 [3] 푸시 고유수용성 위치는 GFP로표시되고 488nm 여기를 사용하여 이미지화됩니다. 색상(노란색에서 파란색까지)은 샘플에 대한 다양한 신호를 나타냅니다. 자세한 내용은 R. Vaadia et al.[4]에서 확인하고, 이 연구의 스트림 동영상 스트림은 http://bit.ly/SCAPE2019에서 처리할 수 있습니다.
그림 4:실시간으로 제브라피의 심장이 움직이는 모습을 보여 주는 영상에서 가져온 이 삼면화는 100vps에서 캡처되었습니다. 상단 패널은 z 투사를 표시하는 하단 패널은 x 투사를 표시합니다. 심실의 심장실은 카트리지가 열림 상태에서 압축을 반복하는 심장의 다음 연속된 이미지에서 심방으로부터 충전기로 나타납니다. 심장벽의 내피 세포는 EGFP(녹색)로 표시되고 적혈구는 DsRed(빨간색)로 표시됩니다. 두 형광단은 488nm 레이저 광(샘플에서 0.6mW)으로 왔습니다. 비디오를 포함한 특정 내용은 V. Voleti et al. [2]를 참조하시기 바랍니다.
요약
생명 과학에 의해 해동되는 형광 실험실은 실험실, 소파, 캐비닛 및 분리형에서 사건을 일으킬 수 있게 주는 도구로 사용됩니다. 고해상도 다색(3D) 이미지를 생활의 속도에 비교하여 기록하는 기능(4D 챔피언)은 이제 이 연구를 보존하는 중요한 역할을 할 것입니다.
참고문헌
참고문헌
1. M. B. Bouchard 외, Nat. 포토닉스, 9, 2, 113–119 (2015).
2. V. Voleti 외, Nat. 방법, 16, 10, 1054–1062 (2019).
3. C. 던스비, 선택 표현하다, 16, 25, 20306–20316 (2008).
4. R. Vaadia 외, bioRxiv, 467274 (2018).
5. E. M. Hillman 외, 현재. 의견. 신경생물., 50, 190–200 (2018).
6 L. Xu 외, 과학, 368, 6487, eaaz5390(2020).