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생활의 속도에 맞는 고해상도, 다색 3D 이미징
혁신적인 레이저 형광 기술, 스위프 공초점 정렬 평면 여기(SCAPE) 현미경,
이전 방법의 한계를 극복하고 광범위한 생명과학 유용성을 제공합니다.
개요
생명과학의 다양한 분야의 연구자들은 공통적으로 다음을 필요로 합니다.3D 형광 현미경 도구빠른 속도, 높은 픽셀 수, 단일 셀 해상도가 특징이며 표본에 심각한 광손상을 일으키지 않고 이미지를 획득할 수 있습니다. 그러나 수많은 개발과 기술 개선에도 불구하고 대부분의 확립된 기술에는 여전히 이러한 매개변수 중 하나 이상을 손상시키는 절충안이 포함되어 있습니다.
그림 1: SCAPE에서는 라인 프로파일 빔을 사용하여 기본 현미경 대물렌즈의 축외 조명을 통해 광 시트가 비스듬한 각도로 형성됩니다(a). SCAPE는 조명 평면의 일련의 이미지를 캡처하는 동안 광 시트를 스캔하여 체적 이미지를 구축합니다(b).
진행과 절충
예를 들어,공초점 현미경단일 지점을 물리적으로 스캔하는 속도 제한으로 인해 다중 헤르츠 반복 속도로 고해상도로 큰 xyz 볼륨을 이미지화할 수 없습니다. 또한, 픽셀당 체류 시간이 짧다는 것은 가장 빠른 공초점 스캔에 높은 레이저 출력이 필요하다는 것을 의미하며, 결과적으로 실제 샘플에 상당한 광손상이 발생합니다.
그동안2광자 현미경광손상을 극적으로 줄이므로 이러한 단일 지점 접근 방식은 속도/해상도/볼륨 트레이드오프로 인한 동일한 문제에 직면합니다. 최근 개발된 빠른 음향광학 변조기(AOM)를 사용하면 미리 선택된 작은 볼륨을 더 빠르게 스캐닝할 수 있지만, 이 접근 방식은 큰 볼륨이나 움직이는 유기체에 대해서는 사용이 제한됩니다.
기존의 광시트 현미경을 사용하면 전체 xy 평면을 동시에 샘플링할 수 있지만 측면 샘플 접근(따라서 특별한 준비)과 3D 데이터 큐브를 구축하는 데 시간이 필요합니다. 또한 광학 장치와 무대 모션의 동기화로 인해 이러한 기술이 복잡하고 느려집니다.
Columbia University의 Zuckerman Mind Brain Behavior Institute(뉴욕, 뉴욕)의 Elizabeth Hillman 교수와 동료들은 다양한 장착 및 비장착 샘플 형상을 지원하면서 이러한 제한을 피하는 혁신적인 접근 방식을 개발하기 시작했습니다. 그들의 성공적인 결과는 2015년 간행물에서 처음 설명된 SCAPE(공초점 정렬 평면 여기) 현미경 검사법입니다.12019년에 업데이트된 버전인 SCAPE 2.0이 보고되었습니다.2그리고 광범위한 생명 과학의 유용성을 인정한 Leica Microsystems가 이제 라이센스를 부여했습니다.
SCAPE 작동 방식
Hillman은 다음과 같이 설명합니다. "우리는 단일 지점 또는 다중 지점 스캐닝으로는 절대 고속 이미징을 얻을 수 없다고 판단했습니다. 필요한 스캐닝 속도를 얻을 수 있다고 하더라도 각 픽셀의 체류 시간이 너무 짧아 허용 가능한 신호 대 잡음비의 이미지를 얻을 수 없었습니다. 그래서 우리는 광시트 현미경에 대해 생각하기 시작했습니다. 당시 거의 모든 시스템에는 샘플을 중심으로 서로 90°에 위치하는 두 개의 대물렌즈가 필요했습니다. 따라서 질문은 다음과 같습니다. 단일 대물렌즈 구성에 라이트 시트의 다중 픽셀 장점을 결합할 수 있습니까?”
팀은 높은 개구수 대물렌즈의 가장자리를 통과하는 축외 경로를 사용하면 현미경의 실제 xy 평면에 대해 45° 각도에서 여기 광 시트를 생성할 수 있다는 것을 깨달았습니다(그림 1 참조). 이 경사면에서 나오는 형광을 이미지화하기 위해 그들은 경사면 현미경과 유사한 접근 방식을 사용하여 대물 렌즈의 이미징 평면을 회전시켜 카메라의 초점을 정확하게 맞췄습니다.3 Hillman과 그녀의 팀은 대물렌즈 상류의 스캐닝 거울을 사용하여 광 시트를 좌우로 이동시켰으며, 이는 또한 돌아오는 형광 빛을 방향을 바꾸어 이동하는 광 시트에 초점을 유지했습니다. 거울이 움직일 때 평면을 쌓음으로써 현미경은 3D 볼륨의 이미지를 빠르고 반복적으로 생성할 수 있습니다.
SCAPE 2.0(그림 2 참조)의 여러 세부 사항은 설명할 가치가 있습니다. 경사면(즉, 시야 축과 각도를 이루는 광 시트)을 이미징하는 문제는 캡처된 형광을 중계하여 두 번째 대물렌즈를 사용하여 중간 지점에서 실제 경사 이미지를 형성함으로써 해결됩니다. 그런 다음 이 이미지는 카메라에 광 시트 평면의 초점을 맞추기 위해 각도(약 127°)로 배열된 두 번째 대물 렌즈를 통해 캡처됩니다.
그림 2: 이동식 정렬 거울은 SCAPE 2.0의 핵심 요소 중 하나입니다.
카메라의 최종 이미지는 샘플 내부의 비스듬한 y-z 평면이며 일반적으로 직사각형입니다. 대부분의 조직에 대한 빛의 침투가 제한되어 있기 때문에 z 방향(y에 비해)이 더 좁습니다. 이러한 샘플에서는 더 빠른 속도의 이미징이 가능하므로 제한된 수의 행(z 깊이에 해당)만 판독하도록 카메라를 작동하는 것이 유용합니다. 예를 들어 사용된 카메라에 따라 1000~18,000fps 사이에서 200행을 판독할 수 있습니다.
스캔 동기화 문제는 다각형 거울을 사용하여 광시트를 스캔함으로써 먼저 해결되었습니다. 검출 경로는 여기광에 의해 사용되는 면에 인접한 면을 포함합니다. Hillman은 "이 다각형은 SCAPE의 원래 영감이었지만 곧 단일 검류계 거울을 사용하는 것이 더 간단하고 효과적이라는 것을 깨달았습니다. 이러한 변화로 인해 시스템 구축이 더 쉽고 저렴해지고 더 많은 빛이 카메라로 되돌아오며 시스템의 스캔 패턴을 더 쉽게 제어할 수 있게 되었습니다."
갈보 미러 외에 움직이는 부품이 없는 SCAPE의 전체 속도는 카메라 프레임 속도와 신호 대 잡음비(SNR)에 의해서만 제한됩니다. 특정 실험에 따라 갈보 미러는 전례 없는 10-100vps(초당 볼륨)에 해당하는 10~100Hz 사이에서 스캔됩니다. SCAPE는 기존의 톱니형 스캔 패턴, 즉 선형 스위프에 이어 거의 즉각적인 재설정을 사용합니다. 갈보 스윕의 진폭과 스윕당 카메라 프레임 수에 따라 시스템의 시야와 x 방향의 샘플링 밀도가 결정됩니다. 더 빠른 카메라를 활용하여 볼륨 속도, 샘플링 밀도 또는 시야를 높일 수 있습니다. 팀의 이미징 대부분은 표준 sCMOS 카메라를 사용했지만 강화 장치가 통합된 초고속 CMOS 카메라를 사용하여 300vps 이상의 이미징에 도달했습니다.
광 시트가 이미지 보기 축 z에 대한 각도로 스윕되기 때문에 각 깊이 슬라이스는 다음 슬라이스에 대해 약간 오프셋됩니다. 현미경의 컴퓨터는 간단한 변환을 사용하여 이 '기울어짐'을 수정하고 왜곡되지 않은 3D 이미지 볼륨을 생성합니다.
디지털 레이저 변조
기능적 지표 및 형광 단백질을 포함한 여러 형광단을 동시에 모니터링하면 동적 행동(예: 근육 활동)과 분자 구성, 세포 구조, 신경 신호 등과의 상관 관계를 확인할 수 있습니다. SCAPE는 플러그 앤 플레이를 통해 다중 파장 여기를 제공하여 이러한 애플리케이션을 쉽게 지원합니다.바카라 카지노 OBIS 광학 펌핑 반도체 레이저(OPSL)—카메라에서 스펙트럼으로 분리된 두 개 이상의 이미지를 나란히 동시에 획득하는 옵션이 있습니다.
Hillman은 이전 레이저 유형과 비교하여 이 작업에 대한 OPSL 기술의 몇 가지 혁신적인 이점을 인용합니다. 그녀는 사용 가능한 파장과 전력 수준이 광범위하다는 점에 주목합니다. "몇 년 전에는 488nm, 532nm, 638nm가 있었는데 사용 가능한 출력 수준을 원한다면 딱 그 정도였습니다. 노란색과 주황색에는 옵션이 없었습니다. 하지만 오늘날 우리는 일반적으로 사용 가능한 거의 모든 형광단의 여기와 거의 일치하는 파장에서 수십, 수백 밀리와트의 레이저 소스를 선택할 수 있습니다." 그녀는 대부분의 SCAPE 시스템이 여러 개의 자유 공간 레이저를 통합하여 광섬유 결합보다 더 많은 유연성을 제공한다고 설명합니다. "레이저가 콤팩트하고 모두 동일한 폼 팩터와 동일한 전자 인터페이스를 갖는다는 점은 매우 편리합니다." 현재까지 Hillman은 일부 실험에서 최대 5개의 레이저 파장을 사용했다고 말했습니다. 또한 그녀는 정기적으로 SCAPE를 워크숍과 교육 과정에 참여하고 최소한의 재배열로 사용 가능한 OBIS 레이저를 사용한다고 설명합니다.
디지털 이미징은 OPSL의 또 다른 중요한 기능입니다. OPSL은 최대 25kHz의 속도로 켜고 끌 수 있으므로 여기 파장은 정확한 타이밍으로 연속 프레임에서 교대로 바뀔 수 있습니다. 이는 이색성 필터와 거울로 구성된 실험실 제작 이미지 분할기를 사용하는 다중 파장 감지로 보완됩니다. 이 장치는 단일 파장 작동에 비해 이미징 속도에 영향을 주지 않고 최대 1280복셀 폭의 시야로 스펙트럼으로 분리된 이미지를 투사합니다.
힘과 범위를 보여줌
최근 두 건의 공동 연구에서는 SCAPE의 힘과 범위를 보여줍니다.
신체, 뇌 및 신경계 전체를 포함하는 작은 유기체의 영상화는 신경과학의 추세입니다. Hillman과 동료들은 최근 살아있는 초파리 유충에서 유전적으로 암호화되고 칼슘에 민감한 형광 단백질의 고속 3D 이미징을 설명하는 연구를 발표했습니다(그림 3 참조). 연동 기어가는 동안 유충의 신체와 신경계의 복잡한 역학을 포착하는 것 외에도 팀은 체벽을 따라 뉴런이 변형될 때 어떻게 발화하는지 추적했습니다.
또한 팀은 SCAPE를 사용하여 살아있는 설치류 피질5의 신경 수상돌기와 마우스 코의 후각 감각 뉴런6의 동적 발사를 연구하고6 자유롭게 움직이는 전체 이미지를 촬영했습니다.C. 엘레강스 회충. 게다가 그들은 배아 제브라피시 심장이 뛰는 극적인 동영상을 제작했습니다.2
배아 제브라피시 심장에 대한 연구는 구조와 기능에 대한 유전적, 환경적 요인의 영향을 포함하여 척추동물 심장 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 기존 현미경 검사법에서는 자연 심박수 2~4Hz로 인해 불규칙 부정맥과 같은 세부 사항을 필연적으로 놓치는 시간 게이팅이 필요하며, 적혈구(RBC) 흐름 분석을 위한 완전한 4D 입자 추적을 수행할 수 없습니다. Hillman의 팀은 소아 심장학자인 Kimara Targoff 교수와 협력했습니다. 그의 연구실은 제브라피시를 사용하여 배아에서 심장 기형을 일으킬 수 있는 유전적 돌연변이를 해독합니다. 공동 노력을 통해 100vps 이상의 속도로 박동하는 심장을 통과하는 두 적혈구의 비디오를 캡처하고 GCaMP 라벨링을 활용하여 박동하는 심장을 통과하는 칼슘 활동의 개별 파동을 캡처했습니다(그림 4 참조).
그림 3:10vps에서 SCAPE 2.0으로 캡처한 움직이는 초파리 유충의 세 이미지에서 [3] 복부 고유 감각 뉴런은 GFP로 라벨이 지정되고 488nm 여기를 사용하여 이미지화됩니다. 색상(노란색에서 파란색까지)은 샘플에 대한 다양한 깊이의 신호를 나타냅니다. 자세한 내용은 R. Vaadia et al. [4] 그리고 이 연구의 실시간 비디오 시퀀스는 http://bit.ly/SCAPE2019를 참조하세요.
그림 4:실시간으로 제브라피시 심장 박동을 보여주는 비디오에서 그린 이 삼부화는 100vps로 캡처되었습니다. 상단 패널에는 Z 투영이 표시되고 하단 패널에는 X 투영이 표시됩니다. 심장의 심실은 유출 밸브가 열린 상태에서 압축되기 시작하고 연속 이미지에서 심방에서 채워집니다. 심장 벽의 내피 세포는 EGFP(녹색)로 표시되고 적혈구는 DsRed(빨간색)로 표시됩니다. 두 형광단 모두 488nm 레이저 광(샘플에서 0.6mW)으로 여기되었습니다. 비디오를 포함한 자세한 내용은 V. Voleti et al. [2]
요약
생명 과학 전반에 걸쳐 형광 현미경은 연구자들이 분자, 세포, 기관 및 유기체 수준에서 사건을 연결할 수 있는 도구로 사용됩니다. 고해상도 다색(3D) 이미지를 삶의 속도, 즉 4D 현미경으로 기록하는 능력은 이제 이 연구를 가속화하는 데 핵심적인 역할을 할 준비가 되어 있습니다.
참고자료
참조
1. M. B. Bouchard 외, Nat. 포토닉스, 9, 2, 113–119 (2015).
2. V. Voleti 외, Nat. 방법, 16, 10, 1054–1062 (2019).
3. C. 던스비, 선택. 익스프레스, 16, 25, 20306–20316 (2008).
4. R. Vaadia 외, bioRxiv, 467274 (2018).
5. E. M. Hillman 외, 현재. 의견. 신경생물., 50, 190–200 (2018).
6. L. Xu 외, 과학, 368, 6487, eaaz5390(2020).