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Becker & Hickl GmbH – Photonenzählung을 위한 Technologieführer – Hat bereits gezeigt, dass kleine Femtosekunden-Faserlaser als preiswerte Anregungsquellen für Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebungssysteme verwendet werden können. Mit einer Wellenlänge von 780 nm, 40 MHz bis 80 MHz Pulsrate und einer durchschnittlichen Leistung von 100 mW bis 500 mW eignen sich die Laser nicht nur für die Anregung von NAD(P)H, sondern auch für eine Vielzahl anderer 형광단 [1, 2], einschließlich solcher mit extrem kurzer Fluoreszenzlebensdauer [3, 4, 5].

Becker und Hickl waren daher daran interessiert, zu sehen, wie sich der축삭Femtosekunden-Laser bei diesen Anwendungen verhalten würde.

Abb. 1: 응집성 Axon 780 레이저

 

시스템 아키텍처

Als 테스트 시스템 버전은 bh DCS-120 MP Multiphotonen-FLIM-System입니다. Die Architektur dieses Systems ist in Abb. 2 다게스텔트. 

Der Laserstrahl des Axon 780 Laser wird über einen freien Strahl in den DCS-120 Scankopf eingespritzt. Im Inneren des Scankopfes wird er von zwei schnellen 검류계 abgelenkt. Die Linse des Scankopfes projiziert den Laserstrahl in das Mikroskop. Im Inneren des Mikroskops passiert der Strahl einen dichroitischen Strahlteiler und wird auf die hindere Öffnung der Linse projiziert. Die Linse des Mikroskops fokussiert den Strahl in die Bildebene innerhalb der Probe. Wenn der Strahl vom Galvanometer abgelenkt wird, spiegeln die Laser-Rasterscans den Bildbereich in der Probe.

 

Für eine maximale räumliche Auflösung ist es wichtig, dass der Laserstrahl die hindere Öffnung der Linse vollständig füllt. Bei den üblichen Brennweiten der Scan- und Rohrlinsen ist dies nicht automatisch der Fall. Der Strahl wird daher um den Faktor 1,5 erweitert, bevor er in den Scanner eintritt. Der Strahldurchmesser in der hinderen Öffnung beträgt etwa 12mm, was ausreicht, um die Öffnung selbst der größten Mikroskoplinsen zu füllen. Die Überfüllung der Öffnung은 문제가 없습니다. Der damit verbundene Verlust der Anregungsleistung kann toleriert werden, da der Laser viel mehr Leistung liefert als benötigt.

Fluoreszenzlicht von der Probe wird durch die Linse zurückgeführt und über einen nicht abgetasteten Strahlengang geführt. L1 및 L2는 Endoskop의 영역입니다. Das Endoskop sammelt auch Photonen, die von der Linse nicht perfekt kollimiert werden, z. B. Photonen, die auf dem Weg aus einer Dicken Probe gestreut werden. Das Fluoreszenzlicht wird in zwei Wellenlänge aufgeteilt und von zwei bh HPM-100-40 Hybriddetektoren erkannt [6, 7]. Einzelphotonenpulse der Detektoren은 zwei SPC-180N TCSPC/FLIM-Modulen aufgezeichnet [1]에 있습니다. 다이 SPC-180N 모듈은 Erkennungszeiten der Photonen nach den Anregungspulsen 및 Die Position des Scanners im Moment der Photonenerkennung에 적합합니다. Diese Informationen werden zum Erstellen der FLIM-Bilder verwendet. Dabei handelt es sich um Pixel-Arrays, wobei jedes Pixel in einer großen Anzahl von Zeitkanälen eine vollständige Fluoreszenzabfallkurve enthält [1].

Das Scannen des Laserstrahl und der Strahlausblendung in den Flyback-Phasen wird hardwaregesteuert durch eine bh GVD-140 Scan Controller-Karte. AOM-Steuersignaleingang des Axon-Laser의 Laserintensität erfolgt über를 확인하십시오. Dieses Signal wird auch von der GVD-140-Karte bereitgestellt. Das gesamte System wird von der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware [1] von bh betrieben, die ein vollständig integriertes FLIM-System mit Scannersteuerung, Laser, Datenerfassung und Datenanalyse bietet. Die Benutzeroberfläche des FLIM-Systems ist in Abb. 3개 다게스텔트.

Abb. 3: Hauptbildschirm der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware

 

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FLIM-Bilder, die mit der DCS-120-AXON-Kombination aufgenommen wurden, sind in Abb. 4 비스 Abb. 6 다게스텔트. Für alle Bilder wurde eine 40x, NA= 1,3 Linse verwendet. Die Datenanalyse wurde mit der bh SPCImage NG FLIM 데이터 분석 제품군 durchgeführt. 씨줄. 4 및 Abb. 5 zeigen Farbcodierte FLIM-Bilder der mittleren(amplitudengewichteten) Lebensdauer und des Stoffwechselindikators, a1. Ein Histogramm des ausgewählten Bildparameters(tm oder a1) wird oben rechts angezeigt, eine Abklingkurve an der Cursorposition wird unten rechts angezeigt. Die Abklingparameter am ausgewählten Punkt werden ganz rechts angezeigt.

Abb. 4: Rohhaut, NADH-Bild, 진폭ngewichtete mittlere Lebensdauer des doppelt-exponiellen Zerfalls

 

Abb. 5: Rohhaut, NADH-Bild, 진폭, a1, der Komponte des schnellen Abklingens. a1 ist ein Indikator für den Stoffwechselzustand

 

Abb. 6일차 헤페젤렌. Der Emissionsfilter wurde für den Nachweis von 440 bis 470  nm ausgewählt, wodurch der Spektralbereich auf den Nachweis von NAD(P)H beschränkt wurde. Die obere Nachweisgrenze von 470  nm kann sehr Restriktiv erscheinen. Um den Nachweis von FAD- und FMN-Fluoreszenz zu vermeiden, ist jedoch eine Einschränkung auf weniger als 470nm erforderlich. Diese Verbindungen werden zusammen mit NAD(P)Hangeregt, zeigen aber eine unterschiedliche Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand. Die Daten mit dem MLE-Algorithmen von SPCImage NG 분석과 비교하여 Pixeln des Bildes의 도펠트 지수 Zerfall 매개변수를 사용합니다. Das gezeigte Bild zeigt a1, die Amplitude der schnellen Abklingkomponte. Sie stellt die Menge an ungebundenem NAD(P)H dar. Da sich das gebundene/ungebundene Verhältnis mit dem Stoffwechsel ändert, wird a1 auch als "metabolischer Indikator" bezeichnet [1].

 

Wie zu sehen ist, ist a1 in verschiedenen Zellen deutlich anders. Dies zeigt an, dass der Stoffwechselzustand in verschiedenen Zellen unterschiedlich ist. Eine hohe a1 (blau dargestellt) zeigt an, dass die Metabolisierung glykolitischer ist, eine niedrige a1 ( gelb) zeigt, dass sie oxydativer ist.

 

"Wir haben Demonstriert, dass der 바카라 카지노 Axon 780 Femtosekunden-Laser in Kombination mit bhs PräzisionsscannerOptiken, Detektoren, TCSPC / FLIM-Elektronik und Datenanalysesoftware genaue Informationen über die Metabolisierung lebender Zellen und Gewebe liefert.“Mit seiner internen AOM-basierten Intensitätskontrolle lässt sich der Laser 문제는 다이 SPCM FLIM-Erfassungssoftware von bh integrieren에 있습니다. Strahlstopp-Situationen 및 Flyback-Phasen des Scanners의 Strahlzuschnitt는 Photoschäden에서 Probe를 통해 Intensitätskontrolle schützen을 재현할 수 있습니다. Insgesamt ist die DCS-120 MP / Axon 780-Kombination ein einfach zu bedienendes hochauflösendes, hochempfindliches Zwei-Photonen-Laserscanning-FLIM-Mikroskop. 

 

Referencenzen

1. W. Becker, Das bh TCSPC Handbuch. 10. 오스가베. Becker & Hickl GmbH (2023), verfügbar unter www.becker-hickl.com,  gedruckte Kopien erhältlich bei bh
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Zwei-Photonen-FLIM mit einem Femtosekunden-Faserlaser. Anwendungshinweis, verfügbar auf www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, Mpilroom Spores의 2광자 FLIM이 초소형 Zerfallskomponten을 열었습니다. Anwendungshinweis(2021), verfügbar unter www.becker-hickl.com
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Natürliche Carotinoide의 초고속 형광 붕괴. Anwendungshinweis, becker-hickl.com(2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, hochauflösendes Multiphotonen-FLIM zeigt ultraschnellen Fluoreszenzabfall im menschlichen Haar. Anwendungshinweis, becker-hickl.com(2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, 레이저 스캐닝 현미경의 FLIM 및 FCS 감지: Gesteigerte Effizienz durch GaAsP Hybriddetektoren. 이주. 결의안. 기술. 74, 804-811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH, Sub-20ps IRF-Breite von Hybriddetektoren 및 MCP-PMT. Anwendungshinweis, verfügbar auf www.becker-hickl.com