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광자 계수 장비 분야의 기술 리더인 Becker & Hickl GmbH는 소형 펨토초 광섬유 레이저가 다광자 형광 이미징 시스템을 위한 저렴한 여기 소스로 사용될 수 있음을 앞서 보여주었습니다. 780nm의 방출 파장, 40MHz ~ 80MHz 펄스 속도 및 100mW ~ 500mW의 평균 전력을 갖춘 레이저는 NAD(P)H의 여기뿐만 아니라 매우 짧은 형광 수명[3, 4, 5]을 포함하여 다양한 다른 형광단[1, 2]에도 적합합니다.

Becker & Hickl은 따라서 어떻게 되는지 관심을 갖고 있었습니다.축삭펨토초 광섬유 레이저는 이러한 응용 분야에서 성능을 발휘합니다.

그림. 1: 응집성 Axon 780 펨토초 레이저

 

시스템 아키텍처

테스트 시스템으로 그들은 bh DCS-120 MP 다광자 FLIM 시스템을 사용했습니다. 이 시스템의 아키텍처는 그림 2에 나와 있습니다. 

Axon 780 레이저의 레이저 빔은 자유 빔을 통해 DCS-120 스캔 헤드에 주입됩니다. 스캔 헤드 내부에서는 두 개의 빠른 검류계 거울에 의해 방향이 편향됩니다. 스캔 헤드의 스캔 렌즈는 레이저 빔을 현미경으로 투사합니다. 현미경 내부에서 빔은 이색성 빔 분할기를 통과하고 현미경 렌즈의 후면 조리개에 투사됩니다. 현미경 대물렌즈는 샘플 내부의 이미지 평면에 빔의 초점을 맞춥니다. 검류계에 의해 빔이 편향되면서 샘플의 이미지 영역에 대한 레이저 초점 래스터 스캔이 이루어집니다.

 

최대 공간 해상도를 위해서는 레이저 빔이 현미경 렌즈의 후면 조리개를 완전히 채우는 것이 중요합니다. 스캔 및 튜브 렌즈의 일반적인 초점 거리에서는 자동으로 그렇지 않습니다. 따라서 빔은 스캐너에 들어가기 전에 1.5배로 확장됩니다. 후면 조리개의 빔 직경은 약 12mm로 가장 큰 현미경 렌즈의 조리개도 채울 수 있습니다. 조리개를 과도하게 채우는 것은 문제가 되지 않습니다. 레이저가 필요한 것보다 훨씬 더 많은 전력을 공급하기 때문에 여기 전력의 관련 손실은 허용될 수 있습니다.

샘플의 형광등은 현미경 렌즈를 통해 다시 수집되고, 스캔되지 않은 빔 경로를 통해 공급됩니다. L1과 L2는 잠망경을 형성합니다. 잠망경은 또한 현미경 렌즈에 의해 완벽하게 시준되지 않는 광자를 수집합니다. 두꺼운 샘플에서 나오는 도중에 흩어진 광자. 형광 빛은 두 개의 파장 간격으로 분할되고 두 개의 bh HPM-100-40 하이브리드 감지기에 의해 감지됩니다[6, 7]. 검출기의 단일 광자 펄스는 두 개의 SPC-180N TCSPC/FLIM 모듈에 기록됩니다[1]. SPC-180N 모듈은 여기 펄스 후 광자의 감지 시간과 광자 감지 순간의 스캐너 위치를 결정합니다. 이 정보는 FLIM 이미지를 구축하는 데 사용됩니다. 이는 픽셀 배열로, 각 픽셀은 다수의 시간 채널에서 전체 형광 붕괴 곡선을 포함합니다[1].

플라이백 단계의 레이저 빔 스캐닝 및 빔 블랭킹은 bh GVD-140 스캔 컨트롤러 카드에 의해 하드웨어로 제어됩니다. 레이저 강도 제어는 Axon 레이저의 AOM 제어 신호 입력을 통해 수행됩니다. 이 신호는 GVD-140 카드에서도 제공됩니다. 전체 시스템은 bh의 SPCM 데이터 수집 및 제어 소프트웨어[1]에 의해 작동되며 스캐너 제어, 레이저 제어, 데이터 수집 및 데이터 분석 기능이 완전히 통합된 FLIM 시스템을 제공합니다. FLIM 시스템의 사용자 인터페이스는 그림 3에 나와 있습니다.

그림. 3: SPCM 데이터 수집 및 제어 소프트웨어의 메인 패널

 

결과

DCS-120-AXON 조합으로 촬영한 FLIM 이미지는 그림 4~그림 6에 나와 있습니다. 모든 이미지에는 40x, NA= 1.3 오일 침지 렌즈가 사용되었습니다. 데이터 분석은 bh SPCImage NG FLIM 데이터 분석 제품군을 사용하여 수행되었습니다. 그림 4와 그림 5는 평균(진폭 가중치) 수명과 대사 지표 a1의 색상으로 구분된 FLIM 이미지를 보여줍니다. 선택한 이미지 매개변수(tm 또는 a1)의 히스토그램이 오른쪽 상단에 표시되고, 커서 위치의 감쇠 곡선이 오른쪽 하단에 표시됩니다. 선택한 지점의 감쇠 매개변수가 맨 오른쪽에 표시됩니다.

그림. 4: 돼지 피부, NADH 이미지, 이중 지수 붕괴의 진폭 가중 평균 수명

 

그림. 5: 돼지 피부, NADH 이미지, 진폭, a1, 빠른 붕괴 성분. a1은 대사 상태의 지표이다

 

그림. 도 6은 효모 세포를 보여준다. 방출 필터는 440~470nm를 감지하도록 선택되어 스펙트럼 범위를 NAD(P)H 감지로 제한했습니다. 470nm의 상한 검출 한계는 매우 제한적으로 보일 수 있습니다. 그러나 FAD 및 FMN 형광 검출을 방지하려면 470nm 미만으로 제한해야 합니다. 이들 화합물은 NAD(P)H와 함께 흥분되지만 대사 상태에 따라 다른 의존성을 나타냅니다. 데이터는 SPCImage NG의 MLE 알고리즘으로 분석되어 이미지의 개별 픽셀에 고정밀 이중 지수 감쇠 매개변수를 제공합니다. 표시된 이미지는 빠른 감쇠 구성요소의 진폭인 a1을 표시합니다. 이는 결합되지 않은 NAD(P)H의 양을 나타냅니다. 결합/비결합 비율은 대사에 따라 변하므로 a1을 '대사 지표'라고도 합니다[1].

 

보시다시피, a1은 서로 다른 셀에서 분명히 다릅니다. 이는 세포마다 대사 상태가 다르다는 것을 의미합니다. 높은 a1(파란색으로 표시)은 신진대사가 더 많은 분해적임을 나타내고, 낮은 a1(노란색)은 더 많은 산화적임을 나타냅니다.

 

'우리는 bh의 정밀 스캐너 광학, 검출기, TCSPC / FLIM 전자 장치 및 데이터 분석 소프트웨어와 결합된 바카라 카지노 Axon 780 펨토초 광섬유 레이저가 살아있는 세포와 조직의 대사에 대한 정확한 정보를 제공한다는 것을 입증했습니다.'내부 AOM 기반 강도 제어를 통해 레이저는 bh의 SPCM FLIM 획득 소프트웨어에 원활하게 통합됩니다. 빔 정지 상황에서의 빔 블랭킹과 스캐너 플라이백 단계 및 재현 가능한 강도 제어는 국부적인 광손상으로부터 샘플을 보호합니다. 전체적으로 DCS-120 MP / Axon 780 조합은 사용하기 쉬운 고해상도, 고감도 2광자 레이저 스캐닝 FLIM 현미경입니다. 

 

참고자료

1. W. Becker, bh TCSPC 핸드북. 10판. Becker & Hickl GmbH(2023), www.becker-hickl.com에서 이용 가능, 인쇄본은 bh에서 이용 가능
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, 펨토초 파이버 레이저를 사용한 2광자 FLIM. 애플리케이션 노트, www.becker-hickl.com에서 확인 가능
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, 버섯 포자의 2광자 FLIM은 초고속 붕괴 구성요소를 드러냅니다. 애플리케이션 노트(2021), www.becker-hickl.com에서 확인 가능
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, 천연 카로티노이드의 초고속 형광 감쇠. 애플리케이션 노트, www. becker-hickl.com(2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, 고해상도 다광자 FLIM은 인간 모발의 초고속 형광 감쇠를 보여줍니다. 애플리케이션 노트, www. becker-hickl.com (2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, 레이저 스캐닝 현미경의 FLIM 및 FCS 감지: GaAsP 하이브리드 감지기로 효율성 향상. 마이크. 결의안. 기술. 74, 804-811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH, 하이브리드 감지기 및 MCP-PMT의 20ps 미만 IRF 폭. 애플리케이션 노트, www.becker-hickl.com에서 확인 가능